O DNA e o PCR

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O PCR constitui a mais avançada metodologia de diagnóstico rotineiramente utilizada por laboratórios para diagnóstico de doenças infecciosas.  Isto porque possibilita a detecção especifica do DNA do agente causador da doença através de sua amplificação e posterior visualização. As vantagens desta metodologia incluem especificidade e sensibilidade altas, que contribuem para índices de falso-positivos e  falso-negativos bastantes inferiores aos exames tradicionalmente utilizados.

Inicialmente vamos dar alguns conceitos sobre o DNA. O DNA é a molécula orgânica que quando transcrita em RNA, tem a capacidade de codificar proteínas. Tem a forma parecida com uma escada espiral cuja disposição dos degraus se dá em quatro partes moleculares diferentes. Esta disposição constitui as chamadas quatro letras do código genético.

 

 

 

As informações nas células passam através de um “fluxo de informações” do DNA  (molécula que armazena as informações que ganhou dos seus pais) para o RNA (molécula que lê as informações do DNA e as transporta para os citoplasma) para as proteínas (tradução das informações trazidas pelo RNA para uma molécula diferente que são as proteínas).

Cada ser vivo que habita a Terra possui uma codificação diferente de instruções escritas na mesma linguagem em seu DNA. Estas diferenças geram as diferenças orgânicas entre os organismos vivos. O DNA se encontra no núcleo celular e é formado por quatro nucleotídeos diferentes,que formam uma estrutura semelhante a uma escada em espiral. Os nucleotídeos são formados por uma base nitrogenada, uma desoxirribose e um grupamento fosfato. O DNA apresenta quatro bases distintas, Adenina, Timina,Guanina e Citosina. Estas bases se combinam aos pares: adenina interage com timina por meio de duas ligações de hidrogênio, enquanto guanina interage com citosina por meio de três ligações de hidrogênio. A sequência de pares de bases se assemelha aos degraus, enquanto a desoxirribose e o grupamento fosfato se alternam, apresentando semelhança com o corrimão de uma escada em espiral. A dupla cadeia polinucleotídica constitui a molécula de DNA, cuja seqüência de nucleotídeos codifica as instruções hereditárias, organizadas em genes, que codificam as inúmeras proteínas existentes nas mais variadas células. As moléculas de DNA contêm portanto a informação genética necessária para a codificação das características de um indivíduo, como a cor do cabelo em humanos, o formato da folha ou a morfologia bacteriana.

Como as informações do DNA (seqüências dos nucleotídeos que são as unidades da molécula de DNA) são diferentes para cada ser vivo do planeta e sua classificação em gênero, espécie, etc. tomamos essa vantagem para classificar molecular cada individuo do planeta por uma seqüência própria daquela espécie. PCR constitui uma tecnologia que localiza essa seqüência e amplifica a molécula para “ser vista” e analisada.

 
O PCR
 

PCR é o acrônimo de Polymerase Chain Reaction (em português – reação em cadeia da polimerase). É um método de amplificação (de criação de múltiplas cópias) de DNA (ácido desoxirribonucléico) sem o uso de um organismo vivo, por exemplo, Escherichia coli (bactéria) ou leveduras, ou seja a amplificação é feita por maquina no laboratório..

A base científica da PCR é a duplicação semiconservativa do DNA observada nos seres vivos. Nas células, esta duplicação envolve a separação das fitas do DNA, ligação de pequenos fragmentos de RNA que servirão como iniciadores para a síntese da nova fita pela DNA polimerase. Estes passos podem ser recriados (in vitro) e constituem um ciclo da PCR. Uma PCR convencional contém pelo menos 30 ciclos o que gera, ao final da reação, cerca de 109 moléculas de DNA para cada molécula inicial. Este enorme aumento na quantidade de moléculas de DNA é o que confere a sensibilidade desta metodologia. 

 
 

Esquema de como de uma molécula (impossível de analisar) amplifica-se para bilhões de moléculas tornando-se possível de ser analisada. Esta amplificação é feita no termociclador.

 

 

PCR é sinônimo de  precisão e rapidez. A especificidade  do método faz com que cada espécie apresente uma seqüência única de DNA que a caracteriza.

A rapidez é traduzida pela possibilidade de  diagnóstico em até 48 horas.  Além disso, o PCR dá ampla flexibilidade, pois de acordo com o agente e a patogenia, diferentes tipos de materiais podem ser utilizados para o diagnóstico, como materiais a fresco, biópsia, sangue, urina, fezes, aspirado trato digestivo, citologia, etc. ou materiais fixados em formol ou parafinados (biópsias, peças cirúrgicas, etc.).
 

O uso do PCR sozinho ou como tecnologia combinada é de dimensão tão grande que é quase impossível ser listada.

 

 

Os resultados das amplificações de PCR podem ser lidas após corrida das amostras em gel  de agarose e visualização das bandas (em negro na foto). O gel acima contem 14 faixa (onde  correm os produtos amplificado). A 5ª faixa contem várias bandas usadas para medir o  tamanho das seqüências amplificadas nas outras faixas. As faixas  8 e 9 não contem  bandas porque são controles negativos.

 

Fonte: Genética Molecular Veterinária e Pecuária

 

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